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柱填料和柱规格对C18色谱柱有哪些影响?
  • 发布日期:2020-07-24      信息来源:本站      浏览次数:888
    • 高效液相色谱(HPLC)法选择性高、灵敏度高、分析速度快,而且大部分可以溶解的药物能用该法分析,所以该技术已经成为药物分析的首要选择。以碳十八硅烷化学键合硅胶固定相(C18或ODS)的反相色谱出色地完成了液相色谱分析任务,而且与其他色谱相比,C18反相色谱有明显的优势,它可直接进样分析水溶性样品,因而适用范围广,被誉为“标准固定相分离模式。各国药典涉及使用液相色谱法进行检测的品种当中,C18色谱柱作为固定相应用较为广泛。

       
      C18色谱柱因键合方式的不同、粒径的不同、长度的不同,内径的差异等多方面因素,呈现出不同选择性。这样,在市场上就出现了数百种具有不同分离选择特性的C18色谱柱。如何在市场上繁杂的 C18 柱中寻找到适合自己分析的那款,是一个值得深入探讨的话题。
       
      C18的选用主要考虑2个问题,即柱填料和柱规格对色谱柱的影响。
       
      1、 C18柱的填料对色谱柱的影响 
       
      柱填料的物理性能对填料色谱行为有重要影响。填料主要的物理性能包括如下:颗粒度、孔径、孔体积、键合相化学、含碳量及烷基化处理。
       
      (1)颗粒度是指柱填料的颗粒直径的大小。实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值。如粒径“5μm”并不是柱中填料所有的颗粒直径都是5μm,实际上有一个颗粒分布度。这种分布度对柱反压及柱效有重要作用。一般来说,平均颗粒度越小,颗粒分布度越小,色谱柱效越高,反压亦越高。目前C18柱填料粒径在4~10μm之间。
       
      (2)孔径是指填料颗粒间的孔间隙。一般所说的孔径是指填料的平均孔径。球形填料装柱后平均孔径分布比较窄,柱床结构均匀,柱效高,重现性好;无定形填料平均孔径分布较宽,柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀,谱带扩宽。平均孔径的大小对分离大分子化合物有较大的影响,在分离含有较大分子的样品时可能会有分子排阻效应,或产生吸附效应从而影响定量的回收率及准确度。因而在用反相色谱分离诸如蛋白或多肽样品时应考虑选用大孔径(如30 nm)的反相柱填料。孔体积作为硅胶多孔性的参数,在分离分析较大分子化合物时可作参考,选用较大孔体积的反相柱填料。
       
      (3)化学键合相填料在高效液相色谱法中占有极重要的地位。它可以键合极性较大的有机基团,采用极性较小的溶剂作流动相。亦可键合极性较小的有机基团,选用极性较大的溶剂作流动相。C18色谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的,这类键合反应目前应用较为普遍。如以十八烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应生成烷基化学键合相,商品名为M-Bondapak-C18。
       
      (4)碳含量即填料中的含碳量。传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂,然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量。碳含量增加,柱子的保留值增加。键合相的色谱行为与键合密度有关,也与硅胶的密度及填料的表面积有关,填料的密度越高,填柱所需的硅胶量越多,柱子的含碳量也越高。如果用2种不同密度相同碳含量的填料填充柱子,其保留行为将明显不同。因此,单独以碳含量来预测色谱行为是不够的。
       
      (5)C18硅烷化试剂是一个大于2 nm大分子,因此会与已键合在相邻的硅醇基上的C18硅烷化试剂产生严重的立体位阻。其结果导致在硅胶表面有大量的残留硅醇基没有与硅烷化试剂反应,这些极性的硅醇基在一定色谱条件下会与碱性化合物相互作用引起峰形拖尾,从而可影响定量分析结果。这些问题在一定程度上可以通过烷基化处理加以克服。烷基化处理是在键合相上完成的独立反应,以减少在硅胶表面的硅醇基。烷基化处理采用小分子(如三甲硅烷)的试剂,其空间位阻远小于C18基团。大多数固定相仅有30%可覆盖的键合位置。据报道,通过某些极活跃的化学试剂及特殊的反应条件,覆盖量可高达50%。很好地了解硅胶键合相的物理特性将有助于在高效液相色谱的反应中选择合适的色谱柱。表面上看C18柱虽然化学官能团相同,而实际上不同品牌的C18柱性能可能有很大差别,从而产生不同的分离结果。
       
      2、 C18柱的规格对色谱柱的影响 
       
      柱填料的选择关系到色谱分离的可能性,而柱规格的选择直接影响分析速度、分离能力、检测能力及每次分析的溶剂消耗等。柱规格包括两方面:柱内径和柱长度。柱内径,分析型一般为2~6 mm,制备型20 mm,大者可达80 mm;柱长度,分析型5~30 cm,制备型15~50 cm。一般来说,柱内径不影响分离度与分析时间的关系。今天,柱技术已发展到不同柱内径的柱子能够具有相同的性能。不同内径的柱子又各具特点,对相同的分析时间和分离度来说,内径大的柱子比内径小的柱子多消耗溶剂。另一方面,较小内径的柱子对相同的检测信号来说所需样品量亦较少。因此,在样品量有限时,可使用小内径柱。柱长度增加虽可改善分离效果,但阻力也随之增加,必须提高入口压力。柱压是同时影响增加分离度和减少分析时间的主要障碍。分离度、分析时间及柱压三者相互制约,选择好其中两者,则第3个因素也就选好了。长柱可以给出高分离度,短柱可提供快速分离,我们可以根据样品情况去选用合适的色谱柱。

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